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一、流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡史

　　流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點(diǎn)是：①測量速度快，*快可在1秒種內(nèi)計(jì)測數(shù)萬個(gè)細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。

　　概要說來，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來人們?cè)谶@方面的心血和成果。

　　1934年，Moldavan₁首次提出了使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置計(jì)測的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于測量靜止的細(xì)胞，因?yàn)橐�使單個(gè)細(xì)胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的淤阻。1953年Crosland –Taylor根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的研究認(rèn)識(shí)到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。

　　1956年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter 計(jì)數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過一個(gè)小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會(huì)影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號(hào)，測量電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計(jì)了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測設(shè)備計(jì)數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計(jì)數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計(jì)數(shù)技術(shù)的主要?dú)v程。

　　現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個(gè)新設(shè)想：（1）細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來定量測定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。（2）細(xì)胞的不同組分可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測量，從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。換句話說，對(duì)同一細(xì)胞可以同時(shí)獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，用作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是個(gè)把計(jì)算機(jī)接口接到儀器上并記錄分析了多參數(shù)數(shù)據(jù)的人，也是個(gè)采用了二維直方圖來顯示和分析多參數(shù)的人。

　　流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們?cè)?967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計(jì)的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。Gohde 和Dittrich接著把這項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱�，他們用流式�?xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)問題。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒有多大差異。

　　近20年來，國內(nèi)外在FCM上都做了不少的研究和應(yīng)用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們?cè)絹碓街铝τ跇悠分苽�、�?xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。FCM在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用也大致差不多，并注重了在臨床應(yīng)用的推廣。

　　二、流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理

　　流式細(xì)胞計(jì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個(gè)細(xì)胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細(xì)節(jié)　分辨率為零。國外又把流式細(xì)胞計(jì)稱作熒光激活細(xì)胞分選器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS）。美國Becton—Dickinson 公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞計(jì)系列均冠以FACS字頭。目前我國國內(nèi)使用的儀器多為美國、西歐及日本等國的產(chǎn)品，國內(nèi)有些單位也已研制成功，但尚無定型產(chǎn)品面市。

　　1．流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。圖10-1為其結(jié)構(gòu)示意圖。

　�。�1）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。

　�。�2）激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是*常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線*強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長λ。為了進(jìn)一步使檢測的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測兩種以上的波長的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

　�。�3）光電管和檢測系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測量的。光電倍增管（PMT）*為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10³到10⁸可連續(xù)調(diào)節(jié)　，因此對(duì)弱光測量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；陽極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。

　　從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過程的信號(hào)，例DNA測量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽性和強(qiáng)陽性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)　便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。

　�。�4）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，*后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

　　2．流式細(xì)胞計(jì)的工作原理下面分別簡要介紹流式細(xì)胞計(jì)有關(guān)的參數(shù)測量、樣品分選及數(shù)據(jù)處理等工作原理。

　�。�1）參數(shù)測量原理：流式細(xì)胞計(jì)可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測量是在測量區(qū)進(jìn)行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過測量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。

　　在流式細(xì)胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0^。角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90^。角散射。這時(shí)所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。

　　在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測量*有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

　　熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測量中，對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說來，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。

　　減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。

　�。�2）樣品分選原理：流式細(xì)胞計(jì)的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的�？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進(jìn)行分選的。

　　穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號(hào)頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數(shù)十ms。精確測定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲�？筛鶕�(jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。

　�。�50）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

　�、贁�(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點(diǎn)圖（dot plot）、二維等高圖（contour ）、假三維圖（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。

　　直方圖是一維數(shù)據(jù)用昨*多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，橫座標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)��?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”（Channel No .）來表示,實(shí)質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強(qiáng)度。縱座標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。

　　二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。橫座標(biāo)和縱座標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)座標(biāo)植的細(xì)胞存在（圖10-3）�？梢杂啥�維點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維座標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn)，這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

　　二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。

　　假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱座標(biāo)—細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)　，這無疑是有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。

　　列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式，三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來完成的�？捎肔ist Mode中的特殊技術(shù)，開窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。

　　上面簡要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。

　�、跀�(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用*小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。

　　逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們�？梢杂脕砹私鈹�(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示*終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。

　　逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對(duì)照組和測試組�？紤]到FCM的可靠性，要注意到對(duì)每組測量，都要有對(duì)照組，對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對(duì)兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。

　　因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。

　　3．流式細(xì)胞計(jì)的技術(shù)參數(shù)　為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個(gè)技術(shù)參數(shù)或指標(biāo)來定量說明。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)常用的技術(shù)指標(biāo)有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數(shù)等。

　�。�1）熒光分辨率：強(qiáng)度一定的熒光在測量時(shí)是在一定道址上的一個(gè)正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的*小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值）來表示。C.V的定義式為：

　　C.V=σ/μ

　　式中，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，μ是平均值。

　　在實(shí)際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。

　�。�2）熒光靈敏度：反映儀器所能探測的*小熒光光強(qiáng)的大小。一般用熒光微球上所標(biāo)可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素）的*少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。

　�。�3）分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。

　　（4）樣品濃度：主要給出儀器工作時(shí)樣品濃度的適用范圍。一般在10^5～10⁷細(xì)胞/ml的數(shù)量級(jí)。

　　其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。

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　　4．流式細(xì)胞計(jì)的調(diào)試和使用　古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù)，必需先對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細(xì)胞計(jì)的調(diào)試項(xiàng)目及要點(diǎn)、使用的程序等等。

　�。�1）調(diào)試和校準(zhǔn)：流式細(xì)胞計(jì)在使用前，甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和*佳性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測量區(qū)的光路等。

　　激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為。

　　液流速度：可通過操作臺(tái)數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。

　　測量區(qū)光路調(diào)節(jié)�。哼@是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90^。散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。

　　流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對(duì)值，因此需要在使用前或使用中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過相對(duì)測量獲得絕對(duì)的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強(qiáng)度藥盒，在免疫實(shí)驗(yàn)中可用來作為定量熒光標(biāo)準(zhǔn)來測定每個(gè)細(xì)胞所標(biāo)記的抗原位點(diǎn)數(shù)目。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，*后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測光信號(hào)為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　　（2）儀器的操作和使用：

　�、俅蜷_電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；

　�、诖蜷_氣體閾，調(diào)節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

　�、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

　�、芾�用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0^。和90^。散射的熒光強(qiáng)度*強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為*�。�

　�、葸x定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程；

　�、迾悠窚y量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

　�、咭�?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

　�、鄬⑺�需結(jié)果打印出來。

　　在操作和使用中一定要注意如下事項(xiàng)：　

　　1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線下以后，需要較長時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2）光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

　　3）液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；

　　4）注意根據(jù)測量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

　　5）特別強(qiáng)度每次測量都需要對(duì)照組。

　　本節(jié)　著重介紹了流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理、技術(shù)指標(biāo)及使用操作中的基本問題。由于實(shí)際使用的儀器廠家、型號(hào)差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說明書使用。至于流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一些具體技術(shù)途徑則在下節(jié)　詳細(xì)介紹。

第二節(jié)　FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)方面的應(yīng)用

　　流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。本節(jié)　概要介紹它們的技術(shù)途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細(xì)胞化學(xué)密切相關(guān)的。

　　一、FCM應(yīng)用的技術(shù)途徑

　　FCM是通過測量細(xì)胞的多種參量來獲取信息的。細(xì)胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量兩大類。結(jié)構(gòu)參量主要用于描述細(xì)胞的化學(xué)組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細(xì)胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經(jīng)熒光標(biāo)記方可測定，有的并不需要熒光標(biāo)記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內(nèi)pH值和細(xì)胞大小等為結(jié)構(gòu)參數(shù)；細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、特殊配體的鑒定、特殊細(xì)胞的生物活性等則為功能參數(shù)。

　　1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標(biāo)記后測出。對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的測定可用于細(xì)胞生物學(xué)方面的研究和臨床腫瘤學(xué)的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測和計(jì)數(shù)；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細(xì)胞周期中的G₀和G₁期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange）、派洛寧Y（PY，Pyronine Y）、HO（Hoechst）系列和色霉素A₃（CA₃）等。利用HO/CA₃雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結(jié)合Brdu （Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷）單克隆抗體免疫熒光來測定細(xì)胞內(nèi)DNA合成。

　　2．蛋白質(zhì)總量測定用FCM可以測定細(xì)胞中蛋白的總含量，以檢測一個(gè)細(xì)胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細(xì)胞亞群，如血液中的白細(xì)胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate），F(xiàn)ITC以共價(jià)鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合。

　　3．特殊配體的測定配體是與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異結(jié)合很強(qiáng)的各種大分子和小分子，通過對(duì)特異性的熒光標(biāo)記的配體的測定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。例如用標(biāo)記的外源凝集素可檢測細(xì)胞表面糖；用標(biāo)記抗體可測表面抗原；用標(biāo)記多聚陽離子可檢測細(xì)胞表面電荷；用標(biāo)記的激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可檢測細(xì)胞受體；用標(biāo)記的大分子、微生物等可檢測細(xì)胞的內(nèi)吞性；用熒光素標(biāo)記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細(xì)胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應(yīng)用范圍廣、有前途，已經(jīng)成為研究細(xì)胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強(qiáng)有力的新技術(shù)。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等）、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。

　　4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細(xì)胞本身的死活；②活細(xì)胞生物功能發(fā)揮的強(qiáng)弱。前項(xiàng)工作單一，后項(xiàng)工作要復(fù)雜得多。FCM用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate）它可被活細(xì)胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細(xì)胞有損傷則會(huì)從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細(xì)胞膜，但能對(duì)固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide）和溴化乙錠（EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。

　　用FCM來測定活細(xì)胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標(biāo)很多。例如可用來測細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞內(nèi)鈣等，這些都和細(xì)胞的激活密切相關(guān)。FCM也可用來測膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性或微粘度等。有報(bào)告可以用FCM代替⁵¹Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細(xì)胞（NK, Natu-ral killer cells）對(duì)靶細(xì)胞毒理學(xué)活性的大小。

　　二、FCM的典型應(yīng)用簡介

　　下面簡單介紹FCM在各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用的典型實(shí)例，以求對(duì)FCM應(yīng)用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的背景。

　　1．在細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用*廣泛也是*基本的領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析是其基本分析內(nèi)容，而實(shí)施的技術(shù)途徑是通過測定細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量來達(dá)到的。

　　眾所周知，細(xì)胞周期由G₁期、S期、G₂期和M期所構(gòu)成的。各期細(xì)胞的DNA含量如下：G₁期為2C，G₂期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G₁峰的道數(shù)恰好是G₂和M峰道數(shù)的一半（圖10-7）。研究表明：對(duì)于正常細(xì)胞群，各周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)的比例是同一的；對(duì)于惡性病變的細(xì)胞群則是非均一的（圖10-8）。

　　臨床腫瘤病學(xué)已經(jīng)注意到細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的重要性。研究工作表明：腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感程度與細(xì)胞的增生率高低密切相關(guān)；采取細(xì)胞同步化（Cell Synchronization）措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞同步化。

　　臨床微生物學(xué)可以用FCM對(duì)大量細(xì)菌的DNA和RNA含量進(jìn)行測量，進(jìn)行微生物鑒定、醫(yī)學(xué)常規(guī)中的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測定。

　　FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域也能充分發(fā)揮。例如流式細(xì)胞核型分析技術(shù)就是用FCM對(duì)染色體進(jìn)行分類、純化，檢測或定量測量細(xì)胞表面或內(nèi)部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預(yù)選擇，以及對(duì)人類計(jì)劃生育等方面的工作。

　　2．在免疫學(xué)方面的應(yīng)用　FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個(gè)方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；�于免疫技術(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。

　　（1）免疫應(yīng)用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線*強(qiáng)。為了擴(kuò)大儀器對(duì)雙標(biāo)記或三標(biāo)記染色的熒光信號(hào)的分辨范圍可使用雙激光光源。

　　為了減少細(xì)胞由于激光束造成的散射光對(duì)光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時(shí)測定兩種波長以上的熒光信號(hào)，光路中還要使用二向性分光元件。

　　為了測定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。

　　總之，應(yīng)用于免疫學(xué)時(shí)要充分考慮有關(guān)光源及光學(xué)濾片系統(tǒng)的正確使用。

　�。�2）免疫應(yīng)用的熒光染料及染色：免疫應(yīng)用中的熒光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻紅蛋白，575nm）及其組合。在進(jìn)行多種標(biāo)記時(shí)特別要注意結(jié)合抗體的每種色素都不干擾抗體反應(yīng)的特異性，也不相互干擾。

　　免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

　�、僦苯尤旧�法

　　1）取約10⁶的細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體要少些。加熒光標(biāo)記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標(biāo)記染色也可直接加入。

　　2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）離心清洗細(xì)胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

　　3）加入適量緩沖液待測。

　　②間接染色法：

　　1）取10⁶細(xì)胞加特異的抗體，4^℃溫度下靜置15～30min。

　　2）加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4^℃靜置30　min。

　　3）緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關(guān)因素干擾，操作盡量在水浴中進(jìn)行。

　　染色中應(yīng)注意的事項(xiàng)：①細(xì)胞標(biāo)本在整個(gè)過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細(xì)胞死亡；②熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用濾膜或高速離心去除顆粒或沉渣以減少非特異性干擾；③細(xì)胞標(biāo)本染色前應(yīng)除死細(xì)胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

　�。�3）免疫熒光標(biāo)本的特殊處理：

　�、偎兰�(xì)胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細(xì)胞及碎片，影響分析結(jié)果。對(duì)于血細(xì)胞可用FCM通過0^。散射的差異不經(jīng)染色而將死細(xì)胞分出棄除；對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，由于其大小分布不均，可在樣品內(nèi)加少量PI染色后將死細(xì)胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

　�、跇�(biāo)本的保存和固定：實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)樣品在染色或分析前需要保存一定的時(shí)間，有時(shí)甚至需要進(jìn)行固定。

　　未染色的新鮮標(biāo)本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷細(xì)胞在-70^℃過夜，然后置液氮中可長期保存。

　　免疫染色未經(jīng)固定的標(biāo)本在4^℃可保存48h。若需存放時(shí)間較長、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4^℃溫度保存。一般來說，經(jīng)固定處理的標(biāo)本保存1周至2個(gè)月，多數(shù)樣品的陽性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度增色能保持在正常范圍之內(nèi)。

　　（4）主要檢測的免疫指標(biāo)：

　�、偌�(xì)胞毒試驗(yàn)：細(xì)胞毒是機(jī)體的一種免疫監(jiān)督機(jī)制，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)。例如天然殺傷細(xì)胞NK（Natural killer）是一種引起免疫媒介的效應(yīng)物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對(duì)NK細(xì)胞的測量可以做為免疫治療監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指標(biāo)。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。

　�、谕淌晒δ軐�(shí)驗(yàn)：單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細(xì)胞的吞噬能力和速度。

　�、跧型變變態(tài)反應(yīng)的IgE受體細(xì)胞、IgE結(jié)合因子的檢查。

　�、馨麧{Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。

　　3．在臨床方面的應(yīng)用FCM在臨床診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后預(yù)測等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學(xué)、血液病學(xué)等。這些都和FCM在熒光細(xì)胞化學(xué)中的直接應(yīng)用有關(guān)。

　　（1）癌前病變的檢測和預(yù)后評(píng)價(jià)：有效地發(fā)現(xiàn)癌前病變而給予阻斷治療，無疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)　。FCM的探測對(duì)象主要是癌前細(xì)胞，即那些處于正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的量變階段、尚未達(dá)到質(zhì)變的細(xì)胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細(xì)胞外，人類正常的體細(xì)胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞則在其發(fā)生發(fā)展過程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉(zhuǎn)化發(fā)生率與細(xì)胞的不典型增生程度有關(guān)，而細(xì)胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關(guān)系。利用FCM可以定量地測出癌前細(xì)胞的DNA含量并根據(jù)DNA分布直方圖直觀地反映出細(xì)胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細(xì)胞增殖能力變化的動(dòng)態(tài)過程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學(xué)中難以得到的信息。

　　表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞在DNA含量及細(xì)胞周期分布方面的差異。

表10-1　正常與胃癌的胃粘膜細(xì)胞DNA含量方面的差異

　　從表中看出差異是顯著的。我國一些學(xué)者也提出有關(guān)FCM診斷癌腫細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，并已付之臨床應(yīng)用。

　　目前，對(duì)于癌癥病人預(yù)后評(píng)估的主要依據(jù)是病理組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等指標(biāo)，不少人已認(rèn)識(shí)到用FCM來檢測DNA是對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)較為客觀有效的指標(biāo)�？偟膬A向是：異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預(yù)后較好。

　　在臨床血液學(xué)方面的應(yīng)用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預(yù)后關(guān)系等方面的應(yīng)用為主；其主要技術(shù)途徑也是基于對(duì)DNA倍體分析和細(xì)胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關(guān)的技術(shù)細(xì)節(jié)　將在下節(jié)　以FCM在外周血白細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析方面的應(yīng)用為例詳加介紹。

　�。�2）DNA指數(shù)：由于DNA的非整倍體細(xì)胞是腫瘤的特異性標(biāo)志已經(jīng)得到腫瘤學(xué)界的公認(rèn)，在些學(xué)者提出建議采用流式細(xì)胞術(shù)DNA分級(jí)指數(shù)（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡稱DNA指數(shù)或DI）表示DNA含量的異常程度。根據(jù)1984年分析細(xì)胞學(xué)會(huì)名詞審定委員會(huì)的規(guī)定：

　　一般樣品應(yīng)采用同種或同個(gè)體的正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。在血液學(xué)研究中通常以正常人外周血淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。需要指出的是，在報(bào)告DNA的測定結(jié)果時(shí)必需包括G₀/G₁峰的變異和系數(shù)，即C.V值，若有多個(gè)DNA干系則要給出各個(gè)G₀/G₁峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據(jù)是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現(xiàn)二個(gè)或多個(gè)可以分辨的G₀/G₁峰則可判斷為陽性；c.雖無明顯的G₀/G₁峰的分化現(xiàn)象，但峰的C.V值較大，則可根據(jù)DI數(shù)個(gè)及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。

　　以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的基本原理和技術(shù)途徑介紹了和組織化學(xué)有關(guān)的內(nèi)容，至于一些技術(shù)細(xì)節(jié)　則在下節(jié)　做較為詳細(xì)的說明。

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第三節(jié)　FCM對(duì)外周白細(xì)胞的免疫熒光分析

　　外周血是臨床檢驗(yàn)中的重要標(biāo)本。FCM分析外周白細(xì)胞的主要目的是了解各種白細(xì)胞的數(shù)目與分群情況。這些數(shù)字的變化與臨床的某些疾病有一定的關(guān)系。近年來，由于多種識(shí)別白細(xì)胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，以及對(duì)這些單克隆抗體的直接或間接熒光標(biāo)記物的出現(xiàn)，使得利用FCM的熒光組織化學(xué)分析獲得被測細(xì)胞的多指標(biāo)的更多、更準(zhǔn)確的信息，這無疑對(duì)警覺臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關(guān)外周血的白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及臨床應(yīng)用等方面的問題。

　　一、白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

　　1．白細(xì)胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對(duì)白細(xì)胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對(duì)應(yīng)的單克隆抗體及反應(yīng)陽性的細(xì)胞（見表10-2）。

表10-2　WHO對(duì)白細(xì)胞分化抗原的命名

　　a：急性淋巴細(xì)胞性白血病；b：慢性淋巴細(xì)胞性白血病。

　　2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細(xì)胞懸液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細(xì)胞；②紅細(xì)胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個(gè)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，再將之制成細(xì)胞懸液染色。

　�。�1）全血染色后溶解紅細(xì)胞：由于不少血液標(biāo)本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個(gè)步驟都在一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行，這樣減少轉(zhuǎn)換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞更節(jié)　省時(shí)間。由于此法未將粒細(xì)胞去除，故在用FCM分析時(shí)，要注意排除粒細(xì)胞的干擾。

　　具體操作步驟如下：

　　①全血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

　�、跓晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃（或放于冰上）。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實(shí)驗(yàn)使用10μl。注意蔽光。

　�、塾�3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉(zhuǎn)），5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

　�、苡�2ml氯化銨液（配法見下）在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細(xì)胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導(dǎo)致白細(xì)胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細(xì)胞會(huì)影響對(duì)淋巴細(xì)胞的分析。這是因?yàn)榱馨图?xì)胞在分析圖像上與紅細(xì)胞群接近，在框出淋巴細(xì)胞群時(shí)，會(huì)把部分紅細(xì)胞框定于淋巴細(xì)胞內(nèi)。而紅細(xì)胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結(jié)果。

　　【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH₄Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH₄Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

　　⑤紅細(xì)胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細(xì)胞和細(xì)胞上的抗原，避免有生物危害的標(biāo)本到處污染。

　　⑥將染色完成的細(xì)胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4^℃，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細(xì)胞在冰箱內(nèi)可保存一周，這樣對(duì)工作的安排會(huì)帶來方便。

　�。�2）紅細(xì)胞被溶解后再對(duì)白細(xì)胞染色：此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以了解被染白細(xì)胞的數(shù)量以及存活率。但由于有時(shí)有些標(biāo)本比較敏感，溶解紅細(xì)胞后，還要經(jīng)過多個(gè)染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

　�、偈覝叵路湃�14ml氯化銨在15ml的試管里。

　�、诩尤�0.5～1ml全血，混合3～5min。

　�、哿⒓措x心100～150×g，并用PBS洗2次。

　　④白細(xì)胞計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個(gè)細(xì)胞。

　�、轃晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃，避光。抗體濃度配制如前所述。

　　⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

　�。�3）用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞：用此法可以分離骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體搗碎后的單細(xì)胞懸液等。血液標(biāo)本應(yīng)有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。

　�、倏鼓�全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

　�、谙♂屟�8或40ml置于15或50ml離心管內(nèi)，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007）從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對(duì)血的擾動(dòng)較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時(shí)應(yīng)特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達(dá)不到分離的目的。

　�、垭x心350～400g,30min。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及死細(xì)胞將位于離心管底部，中間層的單個(gè)核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些血小板。

　�、苋〕鲋虚g層中所有細(xì)胞，若在Ficoll中還有細(xì)胞也要取出，這也是單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。

　　⑤用PBS洗3次，第1次清洗時(shí)，可用較快速400×g離心10min。因?yàn)橛锌赡苤虚g層中混有一些ficoll，比重增加而細(xì)胞不易沉降。

　　⑥PBMC計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)高于90%。配成5×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。

　　⑦取出0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內(nèi)含1×10⁶細(xì)胞），用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細(xì)胞膜通透性改變，會(huì)導(dǎo)致熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)入細(xì)胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細(xì)胞一樣。當(dāng)用FCM分析時(shí)，則均為陽性而達(dá)不到檢驗(yàn)?zāi)康摹＿@也是用FCM分析的細(xì)胞存活率應(yīng)高于90%的原因。

　�。�4）熒光標(biāo)記抗體的細(xì)胞染色：如前所述，F(xiàn)CM分析被熒光標(biāo)記的抗體染色的細(xì)胞，在選擇熒光染料時(shí)必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個(gè)公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE），所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當(dāng)則會(huì)招致熒光抗體所染的細(xì)胞分析不出來，這是應(yīng)該注意的。

　　這里的標(biāo)本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項(xiàng)：

　　①在用間接法染色時(shí)，染色步驟依次為抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細(xì)胞溶解。為了實(shí)驗(yàn)的方便，將第二抗體也配成每次實(shí)驗(yàn)用10μl。

　�、陔p色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標(biāo)記的抗體各10μl置入同一個(gè)含有約1×10⁶/0.2ml的試管內(nèi)，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標(biāo)記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等。可按說明使用，具體用量為每次實(shí)驗(yàn)10μl。

　�、蹖�(duì)照組：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對(duì)照是必不可少的。在準(zhǔn)備用FCM分析的細(xì)胞時(shí)，對(duì)照標(biāo)本的制備顯得格外重要。因?yàn)橐淮斡肍CM分析的樣品可能會(huì)很多，甚至多達(dá)上百個(gè)試管。對(duì)同一病人也可能會(huì)用到20～30個(gè)不同的單克隆抗體。每一個(gè)病人都要有相應(yīng)的陰性對(duì)照。陰性對(duì)照主要用于儀器分析細(xì)胞之前，設(shè)立陰性和陽性的分界線。陽性對(duì)照主要用于檢查染色方法。陽性對(duì)照細(xì)胞選自那些已知的細(xì)胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應(yīng)*明顯者。陰性對(duì)照細(xì)胞有以下幾種：

　　1）非染色細(xì)胞：直接染色法時(shí)，用10μl PBS代替與熒光結(jié)合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時(shí)，分別用10μl的PBS代替抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

　　2）使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應(yīng)，因此使用MsIg作為對(duì)照。同時(shí)還需要注意選擇與實(shí)驗(yàn)用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對(duì)照組時(shí)，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時(shí)，用10μl與熒光結(jié)合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時(shí)，用10μl無熒光的MsIg代替抗體。其它步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

　　3）雙染色對(duì)照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結(jié)合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個(gè)試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

　　4）間接法對(duì)照：用10μl的PBS代替抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實(shí)驗(yàn)相同，其它實(shí)驗(yàn)步驟也和實(shí)驗(yàn)組相同。

　　二、白細(xì)胞免疫熒光分析的數(shù)據(jù)分析

　　在儀器調(diào)試和校準(zhǔn)及標(biāo)本制備完畢之后，就要做測試和數(shù)據(jù)分析工作。這里先討論一下有關(guān)數(shù)據(jù)測量和分析的技術(shù)問題，而一些醫(yī)學(xué)應(yīng)用的具體參數(shù)的測量和分析后面做介紹。

　　1.0^。散射和90^。散射的雙指標(biāo)的二維圖像分析　　可以把0^。和90^。散射分別選作二維圖像的X軸和Y軸指標(biāo)。通過圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)分布把全血分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞幾個(gè)亞群（圖10-9）。

　　圖中，A、B圖的淋巴細(xì)胞數(shù)大約有6000～9000個(gè)；C、D圖約有2000～4000個(gè)。分群編號(hào)依次表示：①紅細(xì)胞、死細(xì)胞和渣滓；②淋巴細(xì)胞群；③大顆粒淋巴細(xì)胞；④單核細(xì)胞；⑤粒細(xì)胞。數(shù)據(jù)是對(duì)1000個(gè)細(xì)胞分析得到的。

　　若用單指標(biāo)直方圖，對(duì)PBMC而言，可以把淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分開。見圖10-10中的A、B圖。但對(duì)紅細(xì)胞溶解后的全血，單指標(biāo)圖分辨率則不夠了（圖10-10的C、D圖），圖A、B給出的是經(jīng)ficoll后的PBMC；圖C、D給出的是人外周血白細(xì)胞。圖中數(shù)字編號(hào)所代表的組分和圖10-9相同。

　　由上可見，在分析紅細(xì)胞溶解后的全血時(shí)，必須先采用雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖。從圖上也可清楚地看出，粒細(xì)胞、未被溶解的紅細(xì)胞和一些渣滓，由于不同的體積和致密度，明顯地區(qū)別于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞從而能把它們分開�？吹角宄�的細(xì)胞分群以后，可以在計(jì)算機(jī)的顯示屏上將所要分析的細(xì)胞畫線框出，并通過指令送入存貯器，以后就可只對(duì)框出部分做各種數(shù)據(jù)分析和深入考查。圖10-11就是對(duì)雙指標(biāo)點(diǎn)圖上的淋巴細(xì)胞群框定的示意圖。數(shù)字所表示的意思和圖10-9相同。

　　2．單維直方圖上陰性分界游標(biāo)設(shè)置前面已經(jīng)強(qiáng)調(diào)，在用FCM分析時(shí)，陰性對(duì)照是必不可少的。首先用非染色細(xì)胞，根據(jù)前面介紹的雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖的辦法，將某一細(xì)胞群框定；然后分別選用綠色熒光（GFL）和紅色熒光（RFL）單指標(biāo)直方圖。在直方圖上所出現(xiàn)的細(xì)胞均為陽性。可用改變GFL和RFL增益的辦法，將細(xì)胞恰好調(diào)節(jié)　到左側(cè)并設(shè)立游標(biāo)（圖10-12）。

然后再測試MsIg染色的陰性對(duì)照。某些細(xì)胞，由于膜上的Fc受體可以與對(duì)照抗體鼠Ig非特異性結(jié)合，因而有一定的背景染色，不過這種陽性百分率不應(yīng)超過5%。所以MsIg與非染色細(xì)胞的分界游標(biāo)確立后，以后所測試的標(biāo)本以此為標(biāo)準(zhǔn)，游標(biāo)位置基本不變。

　　MsIg的紅、綠熒光陰陽性分界游標(biāo)確立以后，可以測試實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。首先檢查細(xì)胞分群情況，然后檢查淋巴細(xì)胞群是否落在已輸入計(jì)算機(jī)的淋巴細(xì)胞框定的范圍里。若染色及FCM的工作性能都正常，則框定的位置不會(huì)改變。然后轉(zhuǎn)換成熒光直方圖。若為FITC標(biāo)記的細(xì)胞，則GFL為X軸；若為PE標(biāo)記的細(xì)胞，則用RFL為X軸。由于陰陽性分界游標(biāo)記已確立，細(xì)胞陽性率及圖像均顯示于計(jì)算機(jī)熒光屏上；同時(shí)也可選用其它指標(biāo)和圖像、打印所需的資料等。

　　3．雙染色分析游標(biāo)設(shè)立和熒光校正

　�。�1）游標(biāo)的設(shè)立：游標(biāo)設(shè)立的原理和單染并無不同，但具體要用二維點(diǎn)圖和二維等高圖來完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細(xì)胞測試，將陰性細(xì)胞集中在左下角（圖10-13）。分別為X、Y軸設(shè)立游標(biāo)，再用MsIg的陰性對(duì)照測試�？蓪�X、Y軸游標(biāo)略為移動(dòng)，使位于窗“3”內(nèi)的細(xì)胞（陰性）在95%以上。

　�。�2）紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測器在*佳測試狀態(tài)時(shí)，會(huì)讓部分綠色熒光進(jìn)入紅色熒光探測器。這是因?yàn)橐徊糠旨?xì)胞發(fā)出的綠色熒光波長較長。若用阻斷或?yàn)V色的辦法消除進(jìn)入紅熒光探測器的這部分GRL，就會(huì)大大地降低RFL探測器的靈敏度。因而只好在操作時(shí)，通過電子計(jì)算機(jī)預(yù)入熒光校正，在RFL中適當(dāng)扣除GRL的影響。

　　通常紅色熒光進(jìn)入綠色熒光探測器的情況比較光見，圖10-14給出CD₁₁-PE（T細(xì)胞、RFL）及CD₈-FITC（T抑制細(xì)胞，GFL）雙染細(xì)胞在二維等高圖上進(jìn)行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標(biāo)劃分的四個(gè)窗的陰陽性和圖10-13相同。各窗給出的百分?jǐn)?shù)為該細(xì)胞群所占百分比。圖A表示未經(jīng)校正時(shí)的情形。窗“2”內(nèi)31.46%表示雙陽性細(xì)胞，即在T細(xì)胞中31.46%為抑制細(xì)胞毒細(xì)胞。經(jīng)過適當(dāng)校正，可見有兩群陽性雙標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)（B圖）。高強(qiáng)度部分為真正的CD₈、CD₁₁雙標(biāo)記陽性細(xì)胞；低強(qiáng)度部分屬于CD₈綠色陽性細(xì)胞（NK細(xì)胞）。此時(shí)“2”窗中細(xì)胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過度則會(huì)使各區(qū)的陽性細(xì)胞都減少（圖C）。

1區(qū)：紅色熒光陽性；2區(qū)�。杭t、綠熒光均為陽性；3區(qū)：陰性細(xì)胞：4區(qū)：綠色熒光陽性細(xì)胞

　　雙染色的熒光校正是用電子補(bǔ)償電路來完成的。補(bǔ)償時(shí)先測定一種染料的熒光，此時(shí)除了應(yīng)該接收該熒光的光電倍增管PMT₁有信號(hào)輸出外，另一光電倍增管PMT₂也常會(huì)有微弱輸出。調(diào)節(jié)　補(bǔ)償器使PMT₂的輸出為0；然后再測另一種波長的熒光染料，調(diào)PMT_１的補(bǔ)償器使之輸出也為0；然后再測另一種波長的熒光的染料，調(diào)PMT₁的補(bǔ)償器使之輸出也為0：如此反復(fù)調(diào)節(jié)　，使兩種熒光的探測器都獲得補(bǔ)償。實(shí)際調(diào)節(jié)　時(shí)用的是一種標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，微球上標(biāo)有已知數(shù)量的熒光分子。利用不同的微球可調(diào)整、補(bǔ)償不同熒光的測量通道。需要指出的是：當(dāng)PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動(dòng)時(shí)，都要對(duì)熒光校正做重新補(bǔ)償調(diào)節(jié)　。

　　三、淋巴細(xì)胞亞群的測定及其在臨床醫(yī)學(xué)中的實(shí)用意義

　　淋巴細(xì)胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3），這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機(jī)能。而且某些疾病會(huì)選擇性地?fù)p傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調(diào)。根據(jù)FCM雙熒光分析的結(jié)果，現(xiàn)將不同的抗原和不同的機(jī)能的淋巴細(xì)胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細(xì)胞亞群的表面抗原

　　＋：表現(xiàn)的抗原；－：未表現(xiàn)的抗原；＋／－：主要亞群有表現(xiàn)的抗原；－／＋：抗原僅表現(xiàn)于少數(shù)亞群。

表10－14　淋巴細(xì)胞機(jī)能性亞群

　　外周血白細(xì)胞的機(jī)能，特別是淋巴細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的免疫機(jī)能。近幾年來，用FCM來測定某些疾病的淋巴細(xì)胞及其亞群已成為重要的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，如對(duì)骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的診斷和對(duì)免疫缺陷病的估價(jià)等。測定淋巴細(xì)胞亞群的主要依據(jù)是在于淋巴細(xì)胞表面不同的抗原表現(xiàn)型，而這些表現(xiàn)型又依賴于相應(yīng)的單克隆抗體而被識(shí)別。所以，特異性很高的單克隆抗體結(jié)合的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細(xì)胞的整個(gè)臨床意義尚未完全認(rèn)識(shí)清楚。隨著更多確定淋巴細(xì)胞表現(xiàn)型的試劑的應(yīng)用，F(xiàn)CM對(duì)診斷和治療計(jì)劃的擬定以及預(yù)后的估計(jì)將會(huì)表現(xiàn)出更重要的實(shí)用意義。

　　1．T淋巴細(xì)胞亞群的測定如前所述，在使用FCM分析時(shí)，先用0^。散射和90^。光散射雙指標(biāo)將白細(xì)胞分為三群：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在二維點(diǎn)圖上劃出淋巴細(xì)胞群范圍后，設(shè)立GFL的RFL單指標(biāo)的直方圖。命電子計(jì)算機(jī)僅計(jì)數(shù)所輸入的淋巴細(xì)胞，即劃線框出的那部分細(xì)胞。一般計(jì)數(shù)輸入的細(xì)胞可設(shè)1000～5000個(gè)。直方圖的分析可顯示陽性細(xì)胞的百分率。應(yīng)用輸入細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，就能得到陽性細(xì)胞的絕對(duì)值，即每立方毫米血液中的絕對(duì)值。有時(shí)T淋巴細(xì)胞某亞群的絕對(duì)值比百分率更為重要，因?yàn)樗�可以表明T細(xì)胞某亞群的增高和減少。當(dāng)然，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)也是一個(gè)重要數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確測出。

　　CD₄/CD₈細(xì)胞的比值，有時(shí)也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)。不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項(xiàng)目。在上，淋巴細(xì)胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數(shù)值，各實(shí)驗(yàn)室均需建立自己的標(biāo)準(zhǔn)。平均值一般為1.73～2.00。

　　一般而言，影響淋巴細(xì)胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細(xì)胞的絕對(duì)值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細(xì)胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內(nèi)也有周期性的波動(dòng)：上午CD₄略低，下午4時(shí)之后開始增加，直至次晨，平均波動(dòng)為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細(xì)胞亞群有所變動(dòng)，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細(xì)胞腫瘤，其淋巴細(xì)胞亞群及其比值測量結(jié)果均可能偏離正常范圍。

　　有工作報(bào)道，傳統(tǒng)的T輔助誘導(dǎo)細(xì)胞（CD₄⁺）具有抑制機(jī)能，而在T抑制細(xì)胞毒細(xì)胞（CD₄⁺）中，有些又具有協(xié)助的功能。因此，對(duì)原來設(shè)想的CD₄、CD₈的機(jī)能分群有所混淆。預(yù)計(jì)會(huì)有新的單克隆抗體再從CD₄和CD₈的細(xì)胞中分出。不過就目前看來，不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已用CD₄/CD₈比值結(jié)合淋巴細(xì)胞絕對(duì)值對(duì)多種疾病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)提供了不少有價(jià)值的資料。

　　2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細(xì)胞病毒（HLTV－－III）感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細(xì)胞，而導(dǎo)致CD₄淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈淋巴細(xì)胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復(fù)感染HLTV-III有關(guān)。對(duì)異性性行為活躍的人來講，對(duì)HLTV—IIi 感染的機(jī)會(huì)也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽性的獻(xiàn)血者對(duì)受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會(huì)導(dǎo)致CD₄/CD₈的的比值下降。

　　對(duì)可疑為艾滋病及血清檢驗(yàn)為陽性的人，T細(xì)胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標(biāo)志。初診時(shí)，CD₄細(xì)胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復(fù)的指標(biāo)則是CD₄細(xì)胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標(biāo)記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時(shí)還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽性細(xì)胞增多（圖10-15）。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時(shí)增加時(shí)，預(yù)后比OKT₁₀陽性細(xì)胞低的病情嚴(yán)重。

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細(xì)胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細(xì)胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細(xì)胞明顯增加

　　3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對(duì)于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細(xì)胞表面表現(xiàn)型的研究。

　　在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細(xì)胞性、T細(xì)胞性或骨髓性腫瘤。同時(shí)，還可以證實(shí)一些與細(xì)胞起源相關(guān)的抗原，如普通急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外，可以用適當(dāng)?shù)脑噭�從反�?yīng)免疫過程中來證實(shí)單克隆的腫瘤細(xì)胞的增殖。

　　大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細(xì)胞。而B細(xì)胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來證實(shí)。由于前B細(xì)胞與漿細(xì)胞表面均無免疫蛋白，所以用檢測免疫球蛋白的辦法就只能證實(shí)B細(xì)胞發(fā)育中間時(shí)期的腫瘤。目前，已有一系列的B細(xì)胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實(shí)B細(xì)胞個(gè)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的腫瘤。

　　對(duì)B細(xì)胞腫瘤*有價(jià)值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細(xì)胞正常以育期的前B細(xì)胞、早期B細(xì)胞以及80%～90%的急性淋巴細(xì)胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細(xì)胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細(xì)胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）將能證實(shí)大部分B細(xì)胞來源的腫瘤。圖10-16給出了B細(xì)胞分化的各個(gè)時(shí)期細(xì)胞膜的表現(xiàn)型。來源于B細(xì)胞的腫瘤和正常B細(xì)胞的表現(xiàn)型相似，也就是說，B細(xì)胞前身、成熟B細(xì)胞及*后分化為分泌B細(xì)胞—漿細(xì)胞。

　　由于T淋巴細(xì)胞來源的腫瘤浸潤性較強(qiáng)，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細(xì)胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細(xì)胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T細(xì)胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。這些抗原與腫瘤的細(xì)胞成熟時(shí)間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細(xì)胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細(xì)胞抗原，如CD₁和t ₁₀。而成熟的T 細(xì)胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細(xì)胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時(shí)也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會(huì)出現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞上面。

　　由于腫瘤細(xì)胞的多種來源，很難避免在腫瘤標(biāo)本中混雜正常細(xì)胞，這給FCM的分析帶來技術(shù)上的困難。如殘留的紅細(xì)胞在FCM分析時(shí)，落入淋巴細(xì)胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細(xì)胞各種亞群百分率下降。所以在制備標(biāo)本時(shí)，應(yīng)盡量想法去除紅細(xì)胞。另一種污染是正常細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞之間，這是一個(gè)很頭痛的問題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細(xì)胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計(jì)污染程度對(duì)解釋FCM分析的資料有一定的意義。因?yàn)樵贔CM分析時(shí)，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據(jù)對(duì)污染的估計(jì)，仔細(xì)分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

　　4．FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤分析　　FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的分析在免疫學(xué)研究和臨床診斷上有著重要的實(shí)用價(jià)值，B細(xì)胞的某些特征必須使用FCM來分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問題。

　�。�1）B細(xì)胞的標(biāo)記：B細(xì)胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B細(xì)胞。*早的B細(xì)胞前身，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于細(xì)胞膜表面。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實(shí)以及同時(shí)測定細(xì)胞表面的SIg，對(duì)FCM是很困難的，當(dāng)然今后可能會(huì)用雙染法來解決這樣的難題。大部分成熟B細(xì)胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當(dāng)然這也可能是因?yàn)椴煌�的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來分類B細(xì)胞是不可靠的，因?yàn)锽細(xì)胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無法把B細(xì)胞分類。大部分B細(xì)胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

　　與重鏈相反，B細(xì)胞的整個(gè)發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細(xì)胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細(xì)胞腫瘤。測定方法見（3）。

　　用SIg的缺點(diǎn)是它的“嗜細(xì)胞性”，因?yàn)檎�常B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、激活T細(xì)胞以及所有巨噬細(xì)胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時(shí)，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過的、Fc段也被去除的、僅留下來的F（ab’）₂。

　�。�2）FCM測定B細(xì)胞的臨床指證：

　�、倜庖呷毕�；免疫缺陷可以是先天性或獲得性的。低丙種球蛋白白血癥和無丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細(xì)胞。

　�、诹馨土觯悍呛谓芙鹗喜〉牧馨筒�，80%來源于B細(xì)胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應(yīng)仔細(xì)用FCM對(duì)B細(xì)胞的表現(xiàn)型進(jìn)行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結(jié)等。首先確定腫瘤細(xì)胞的來源：B細(xì)胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T細(xì)胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病來源于單核細(xì)胞（CD₁₁⁺）成裸細(xì)胞而表現(xiàn)出非T非B。一旦確立為B細(xì)胞來源后，就應(yīng)更進(jìn)一步分析克隆增殖的性質(zhì)：單克隆、少克隆、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標(biāo)志�？梢杂肧Ig的輕鏈和重鏈分別加以測試，往往輕鏈比重鏈更有價(jià)值。在不久的將來，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

　　對(duì)B細(xì)胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細(xì)胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B細(xì)胞中這些細(xì)胞較少，而多見于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時(shí)期。在B細(xì)胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現(xiàn)CD₂₀（B₁）陰性反應(yīng)，這是B細(xì)胞成熟而將分化為漿細(xì)胞的標(biāo)志。在異常B細(xì)胞上，往往有一些B細(xì)胞的標(biāo)記缺失或其它表現(xiàn)型出現(xiàn)，因而對(duì)異常B細(xì)胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細(xì)胞）和CD₅-PE（T細(xì)胞）雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂（B細(xì)胞），Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁（T細(xì)胞）。從圖中可見，有較多的細(xì)胞表現(xiàn)出Leu₁₂⁺t Leu₁⁺,陰性區(qū)內(nèi)為NK細(xì)胞和紅細(xì)胞等。

　　（3）k-λ測定B細(xì)胞克�。簁、λ測定法是一種從正常B細(xì)胞中測定少量B細(xì)胞克隆生長的方法。其基本原理是：若有B細(xì)胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ）的熒光強(qiáng)度的分布。若輕鏈為k的B細(xì)胞生長，則抗k的抗體能測試出這種變化，而抗λ的抗體的測試沒有任何改變。正常情況下，B細(xì)胞的k和λ的熒光強(qiáng)度分布是一致的（見圖10-18）。

正常情況，B細(xì)胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒有區(qū)別。但在異常時(shí)，若有單克隆生長，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會(huì)產(chǎn)生差異。

　　在實(shí)際應(yīng)用中，血液、體液、組織細(xì)胞的懸浮液效果均較好，而對(duì)于骨髓，大量細(xì)胞的非特異性標(biāo)記會(huì)影響測定的結(jié)果。這里面必須強(qiáng)調(diào)，正常B細(xì)胞中的克隆細(xì)胞生長并不意味著它們必然是腫瘤細(xì)胞，還必須結(jié)合其它指標(biāo)再做結(jié)論。不過這種方法對(duì)確定腫瘤細(xì)胞的存在、細(xì)胞發(fā)育階段、以及經(jīng)治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

　　以上僅限于從外周血的白細(xì)胞分析這一側(cè)面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應(yīng)用。其實(shí)，它也僅只是問題的一個(gè)部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞成株單元組成的成株細(xì)胞中有所表現(xiàn)。CD₃₄⁺細(xì)胞在人的骨髓細(xì)胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測不到。又如，NK細(xì)胞近來被認(rèn)為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，對(duì)NK細(xì)胞的測量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來檢測NK敏感的靶細(xì)胞的毒理學(xué)活性從而評(píng)估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）標(biāo)記則可用FCM技術(shù)更為安全可靠地進(jìn)行測定。有報(bào)告指出，健康男人的數(shù)值為（67.1±22.7%）%，健康女人為（63.9±20.0%）；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1）%,明顯偏低。這些工作表明，F(xiàn)CM的技術(shù)從免疫組織化學(xué)角度還會(huì)有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們?cè)�簡單介紹了流式細(xì)胞分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程中應(yīng)用的一些技術(shù)途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來提高免疫組織化學(xué)的分析能力�？梢灶A(yù)見，F(xiàn)CM一定會(huì)成為免疫組織化學(xué)的一項(xiàng)重要的技術(shù)工具，并將在醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用。

　　附【美國Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標(biāo)準(zhǔn)】熒光微球（Fluorescent beads）；雞紅細(xì)胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺細(xì)胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA測量的質(zhì)量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它臨床應(yīng)用的藥盒。

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