為了讓觀察更加清晰，讓需要觀察到的現(xiàn)象通過染色暴露出來，或者通過通過染色可以實(shí)現(xiàn)某些鑒別等功效，實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行微生物制片時(shí)都會進(jìn)行染色，一般常用的細(xì)菌染色方法有：
1.六胺銀法(GMS法)
我們在實(shí)驗(yàn)中對Grocott-Go-mori六胺銀法,作如下改進(jìn)。(1)用8%鉻酸代替原法的5%鉻酸,氧化時(shí)間由1h減為20min;(2)六胺銀工作液中原法是用六胺銀貯備液25ml,我們減為10ml,這樣在電熱恒溫箱作用下切片就不容易過度染黑。進(jìn)行六胺銀法染色時(shí),取高身5片染色缸盛六胺銀工作液,置入58~60恒溫箱內(nèi)預(yù)熱30min,把已脫蠟并經(jīng)鉻酸氧化后至水的待染切片,用蒸餾水洗2次后移入已預(yù)熱的六胺銀工作液(加蓋),約20min后取出肉眼觀察,如見切片稍呈淡黃色,即取出切片用蒸餾水洗后置顯微鏡下觀察有否菌體出現(xiàn),如有黃棕色的菌體出現(xiàn),則需按其深淺,以后每隔5~10min再取出鏡檢以控制菌體著色深度,至適度的棕黑色為宜(此步驟很重要),取出切片轉(zhuǎn)入下一步驟。如用水浴箱孵育,度應(yīng)調(diào)至50預(yù)熱5min左右,若調(diào)至60時(shí),則作用較快,切片很快變黑,難以控制,而染色缸壁有時(shí)也呈銀鏡反應(yīng),六胺銀工作液變灰黑色而失效。
六胺銀法可適用于多種真菌染色,但必需掌握孵育時(shí)間。當(dāng)染曲菌和毛霉菌時(shí),如顯色太淡,菌絲灰黃不明顯,難以觀察曲菌菌絲的分隔。如顯色太深,菌絲呈索狀,看不清菌絲的兩側(cè)壁,也看不清菌絲有否分隔;新型隱球菌染色時(shí),如顯色太淺,隱球菌的莢膜不明顯,小的隱球菌不易發(fā)現(xiàn)。如顯色過度,分不清莢膜和菌體;組織胞漿菌如顯色過度,�？床磺寰�,而是一團(tuán)團(tuán)的黑點(diǎn);馬爾尼菲青霉菌,六胺銀法是*li想的方法。
在染色時(shí)更要掌握好溫度和時(shí)間,才能顯示出少數(shù)橢圓形或香腸狀細(xì)胞中的橫壁,這是診斷馬爾尼菲青霉菌的形態(tài)學(xué)特征。六胺銀法染色,可使網(wǎng)狀纖維和纖維蛋白絲也染成灰棕色,只要仔細(xì)辨別即不會與曲菌和毛霉菌混肴。*后復(fù)染一般用橙黃G染1~2s。對于肺曲菌病,可用Mayer蘇木精染核后再復(fù)染伊紅或固綠能獲得滿意的結(jié)果,可以看到曲菌的形態(tài)和其與肺泡、小支氣管和軟骨之間的關(guān)系。但對馬爾尼菲青霉菌,還是單純用橙黃G復(fù)染為佳,因?yàn)榈咨逦?能更好的發(fā)現(xiàn)橢圓形或香腸狀細(xì)胞和其橫壁。此法染色的玻片標(biāo)本數(shù)十年后都不會褪色。
2.碘酸無色品紅法(PAS法)
此法的主要染液為無色品紅液(又稱Schiff試劑),我們是根據(jù)McManus的熱配法,其配制步驟稍多,如能購到合適的偏重亞硫酸鈉,配制較易成功,配妥后密封置冰箱可保存約1年。此法可用于組織胞漿菌染色,也可用于白色念珠菌、曲菌和新型隱球菌的染色。染色前先從冰箱取出無色品紅液,放置約30min使其恢復(fù)至室溫,傾入5片染色缸,把已脫蠟至水并經(jīng)高碘酸氧化的玻片再用蒸餾水洗2次后移入無色品紅液內(nèi)(加蓋),置于暗處作用15~20min。此法染真菌,一般不會過染。無色品紅液在不用時(shí)置于4°冰箱保存,臨用前取出恢復(fù)至室溫使用。一瓶無色品紅液,可反復(fù)使用多次,至呈紅色才傾去換新液。染色后可用Mayer蘇木精淺染胞核。無色品紅液在冬季室溫低于15時(shí),作用緩慢,這時(shí)應(yīng)把無色品紅液置入20~30的水中加溫即可用,但水溫不宜超過30,因溫度過高無色品紅易變成紅色而失效。
3.色品紅醛品紅法(Gridley法)
此法與PAS法相似,但它是用鉻酸代替高碘酸氧化,切片與無色品紅反應(yīng)后,再經(jīng)醛品紅液處理,作用是增強(qiáng)染色。此法的染色效果,一是基于無色品紅的配制是否得宜,另一是基于醛品紅液的配制是否理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),配制醛品紅時(shí),所用的三聚乙醛應(yīng)新鮮,太陳舊和經(jīng)多次開瓶取用的都不好。其次是配制時(shí)的室溫和成熟時(shí)間,室溫在25~30時(shí),置放2d可以成熟,即由配制時(shí)的紅色液轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙Ｈ羰覝剡^低時(shí)可稍加溫置于暖處。此外,配試劑時(shí)要選用純度較高的堿性品紅和鹽酸。醛品紅成熟后置放4°冰箱可保存較長時(shí)間。此方法染色不會過染,對染曲菌和白色念珠菌都很理想。
4.爾辛藍(lán)法(AB法)
阿爾辛藍(lán)法的染液配制簡單,染色步驟簡易。阿爾辛藍(lán)是一種銅酞花青染液,易溶于水,商品有Alcianblue8GS和Alcianblue8GX,兩種皆可用,但后者的特異性強(qiáng),顏色鮮艷,通常配成兩種不同pH值的染液,染真菌應(yīng)用pH25染液(用3%冰醋酸100ml加入阿爾辛藍(lán)1g配成),染色時(shí)間15~20min,此染液穩(wěn)定,置4度冰箱可保存1~2年。此法把新型隱球菌的莢膜染成深藍(lán)色,菌體淡藍(lán)色或無色,其底色可用伊紅復(fù)染即可,此染法標(biāo)本不褪色,可長期保存。
5.液胭脂紅法(Mucincarmine法)
黏液胭脂紅法所用貯備液的配制要經(jīng)過煮沸,其中所用的無水氯化鋁較難保存,開瓶取用后需立即認(rèn)真用蠟密封瓶口,否則很快吸潮失效。在配成貯備液后,放4°冰箱保存可使用約半年。使用時(shí)取貯備液1份,加蒸餾水4份稀釋混合后應(yīng)用,染色時(shí)間20~30min,一般不會過染。有些專書介紹用貯備液直接染色而不用稀釋液,這樣染色時(shí)間可縮短,我們認(rèn)為用貯備液直接染色有時(shí)染色不均勻,所以還是推薦用稀釋液染色,染色后無需分化,操作簡易。在染胞核可用Mayer蘇木精液或Harris蘇木精液,避免用Ehrlich蘇木精染核,因后者可把莢膜淡染,這就妨礙下一步黏液胭脂紅的著色。此法把新型隱球菌的莢膜染成玫瑰紅色,極易診斷,染色后標(biāo)本可長期保存不易褪色。
在外檢標(biāo)本中,真菌感染不少見,如能根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu),輔以特殊染色,是不難診斷的�？偟膩碚f,組織胞質(zhì)菌,采用PAS法,在蘇木精淺染核后即可觀察鑒定。如用六胺銀法,配以橙黃G復(fù)染底色則很清晰;馬爾尼菲青霉菌,可用PAS法,但較理想的是用六胺銀法,配以橙黃G復(fù)染,此法染色的關(guān)鍵是銀液浸染時(shí)間要恰當(dāng);新型隱球菌因菌體外周有一含黏多糖的莢膜,因而需選用黏液胭脂紅法或阿爾辛藍(lán)法,前者把莢膜染成玫瑰紅色,后者把莢膜染成深藍(lán)色,只要有一個(gè)比較典型的真菌被黏液胭脂紅或阿爾辛藍(lán)著染,就可作為診斷依據(jù);對于曲菌和毛霉菌,用六胺銀法都能把菌絲染得很清晰。曲菌染色也可選用PAS法或無色品紅醛品紅法,但此兩法對毛霉菌則染色不佳;白色念珠菌首xuan是無色品紅醛品紅法,其次PAS法和六胺銀法也很理想;放線菌用HE法染色即可觀察,菌體中央部分被蘇木精染成藍(lán)紫色,周邊部的膠質(zhì)樣鞘被伊紅染成紅色。必要時(shí)可作Gram法染色,菌絲為陽性,膠質(zhì)樣鞘陰性。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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